Resumen
- Existen grandes diferencias en el sabor del cacao dependiendo de su
origen de producción. Variedades idénticas, en función de la región en la cual son
producidas proporcionan características de sabor muy diferentes. En el mundo, existen
regiones que producen almendras con excesivo sabor ácido y amargo además de una fuerte
astringencia. Almendras de cacao no fermentadas lo suficiente (color violeta) presentan un
contenido de substancias polifenólicas mayor con relación a las almendras de cacao bien
fermentadas (color marrón), lo cual influye principalmente en la astringencia y el
amargor del cacao. Exceso de amargor y de astringencia puede inhibir la percepción de
otros sabores deseables. Consecuentemente fue estudiada la reducción de substancias
polifenólicas, utilizando la polifenoloxidasa (PPO) parcialmente purificada a través de
la precipitación con (NH4)2SO4 y diálisis;
extraída de la pulpa de chirimoya (Annona squamosa L.) con pH y temperatura óptimas de
6,5 y 20 ºC respectivamente. “Nibs” autoclavados (121 ºC y 15 min.) y no
autoclavados; de almendras insuficientemente fermentadas y secas de la variedad
“Forastero” fueron embebidos en una solución de enzima conteniendo 200
U/min./ml, durante 30, 60, 90, 150, 210 y 360 minutos, a 23º C y pH 6. Los nibs fueron
secados y molidos para después ser desengrasados. Los análisis realizados en el polvo de
cacao desengrasado fueron: fenoles totales, taninos, antocianidinas, flavan-3-ols. Según
los resultados no existe una diferencia significativa (p<0,05) entre los tiempos de
tratamiento de 210 y 360 min. De esta forma los resultados utilizados fueron los obtenidos
con 210 min. de tratamiento. La concentración de fenoles totales en “nibs” de
cacao no autoclavados y tratados enzimáticamente (210 min.) tuvo una baja del 15%, la
pérdida de estos fenoles en “nibs” autoclavados y también tratados
enzimáticamente fue del 24%. En el caso de los taninos, la pérdida en “nibs”
tratados con PPO no autoclavados fue del 15%, y en los autoclavados del 26%. La pérdida
de antocianidinas en “nibs” tratados no autoclavados fue del 18%, y del 51% en
los “nibs” autoclavados. La concentración de flavan-3-ols tuvo una baja del 10%
en “nibs” no autoclavados y de 23% en los autoclavados.
Las semillas frescas de cacao
contienen concentraciones elevadas de pigmentos violeta llamados antocianidinas, durante
la fermentación, éstos pigmentos son hidrolizados debido a la acción de enzimas
glucosidasas resultando en la pérdida de esta coloración violeta en los cotiledones
(FORYSTH & QUESNEL, 1957). A lo largo de la fermentación las antocianidinas
libres son oxidadas por la acción de la polifenoloxidasa hasta quinonas, estas quinonas
pueden formar complejos con aminoácidos y proteínas y después polimerizar con otros
flavonoides hasta formar taninos. Taninos con altos pesos moleculares forman complejos con
proteínas a través de puentes de hidrogeno y el resultado de esta reacción son
pigmentos, insolubles en agua, de color marrón, característica que es necesaria para la
producción de chocolate (HANSEN et al, 1988). También durante este proceso de
fermentación ocurren cambios en los azúcares, polisacáridos y proteínas de las
semillas de cacao. Adicionalmente, productos del metabolismo de los microorganismos
fermentadores de pulpa, se difunden a través de los cotiledones, reaccionando los
diversos componentes de la semilla; asociándose así al conjunto de precursores de sabor.
Después de la etapa de fermentación el color interno de las almendras de cacao
debe ser marrón y no violeta, ya que el color violeta es característico de un producto
mal fermentado con altos tenores de compuestos polifenólicos y está relacionado con un
débil sabor de chocolate. (ROHAN, 1958; LOPEZ & Mc DONALD, 1981).
El proceso de secado influye
también en el sabor, puesto que en esta etapa continúan las reacciones bioquímicas como
la oxidación y polimerización de los polifenoles (MARTIN, 1987). Estas reacciones son
una continuación oxidativa de la fermentación. Los polifenoles son oxidados en la
presencia de oxígeno resultando en la formación de quinonas que sufren polimerización
para la obtención de productos de color marrón. Entre tanto, teniendo en vista su pH
ideal (6,0), en semillas ácidas (pH 4,0 - 5,0) el oscurecimiento es lento durante el
proceso de secado. En un pH > 7,0 los polifenoles son oxidados de manera no
enzimática. Entonces, un cacao muy fermentado fácilmente se torna marrón, dando la
falsa apariencia de una semilla perfectamente fermentada. Una consecuencia de la
oxidación polifenólica y la polimerización de la quinona es la reducción del
sabor astringente (JEANJEAN, 1995).
El porcentaje de células
almacenadoras de compuestos polifenólicos en la almendra de cacao constituye del
11-13% y aproximadamente 90% de las células son almacenadoras de lípidos y proteínas,
el mayor volumen por tanto, compuesto de células almacenadoras de grasa (BELITZ &
GROSCH, 1988). Las células almacenadoras de compuestos polifenólicos, dependiendo del
contenido de antocianinas adquieren color entre blanco y violeta intenso.
La Tabla 1 presenta datos con
respecto a su composición comparada con el tejido total.
| Compuesto |
(%)a
de compuestos polifenólicos en la célula almacenadora |
(%)a
de compuestos polifenólicos en los cotiledones |
| Catequina |
25,0 |
3,0 |
| Proantoclanidina |
21,0 |
2,5 |
| Polímeros de Proantocianidina |
17,5 |
2,1 |
| Antoclaninas |
3,0 |
0,4 |
| Fenoles totales |
66,5 |
8,0 |
| Teobromina |
14,0 |
1,7 |
| Cafeína |
0,5 |
0,1 |
| Azúcares libres |
1,6 |
|
| Polisacáridos |
3,0 |
|
| Otros |
14,4 |
a
Base seca
Tabla 1.
Composición de las Células
Almacenadoras
de Compuestos Polifenólicos
Fuente: BELITZ & GROSCH, 1988
Existen tres grupos diferentes
de fenoles: catequinas (37%), antocianinas (4%) y proantocianidina (58%). La catequina
principal y (–)-epicatequina; También fueron identificadas la (+)-catequina, la
(+)-galocatequina y la (–)-epigalocatequina. La fracción de antocianinas está
formada principalmente por cianidina-3-arabinósido y por cianidina-3-galactósido. Las
proantocianidinas son compuestos que se transforman en antocianinas y catequinas cuando
son calentadas en una solución ácida (BELITZ & GROSCH, 1988). Según CROS et al
(1982), en el estudio de la evolución de los taninos y de los fenoles totales en semillas
de cacao durante la fermentación, existe una disminución, que queda alrededor del 70%,
en el tenor de compuestos polifenólicos presentes en almendras fermentadas durante 8
días en cajas, en relación con el tenor de éstos compuestos en semillas no
fermentadas. Los taninos tienen una evolución muy similar a los compuestos fenólicos,
comenzando la disminución a partir del 3 día de fermentación, punto en el cual
alcanzan su concentración máxima.
Las enzimas endógenas de cacao
tienen una función muy importante para la producción de los precursores de sabor y para
la degradación de los pigmentos durante la fermentación del cacao. Los precursores
de sabor (aminoácidos, péptidos y azúcares reductores) participan de la reacción de
Maillard durante el tostado y forman los compuestos del sabor típico de cacao, con todo,
un gran número de componentes responsables por el sabor de cacao están siendo descritos
y los principios bioquímicos de sus orígenes no están bien definidos (HANSEN et al,
1998)
La presencia de la actividad de
la enzima polifenoloxidasa (PPO), durante la fermentación y el secado de las
almendras de cacao, son los factores menos comprendidos hasta ahora, pero potencialmente
son los dos más significativos en lo que se refiere a la calidad del sabor de las mismas
(MAYER, 1987; VAMOS-VEGYAZO, 1981; citados por WONG, M. K. et. al., 1990). Durante la
producción de chocolate la acción de la PPO es uno de los factores responsables por el
desarrollo de los precursores de sabor, comenzando en la fase oxidativa de la
fermentación y continuando en la de secado (ROELOFSEN, 1958; FORSYTH & QUESNEL,
1963; citados por WONG, M. K. et. al., 1990). El papel actual de esta enzima y la
importancia de la misma en la producción del sabor a chocolate no están bien
comprendidos y requiere de mayores estudios; con todo se tiene asociada una falta de sabor
característico del chocolate con una baja actividad de la enzima o con condiciones que
pueden llevar a reducir dicha actividad. La importancia de esta enzima es frecuentemente
mencionada de forma implícita en la reducción de sabor astringente del cacao (HOLDEN,
1959; citado por REEVES, S. G. et. al., 1988).
Los experimentos fueron
realizados en el Laboratorio de Frutas, Hortalizas y Productos Azucarados del Departamento
de Tecnología de Alimentos de la Facultad de Ingeniería de Alimentos de la UNICAMP.
Fueron utilizadas almendras de
cacao fermentadas y secas de la variedad “Forastero”, provenientes de Bahia.
a)
Preparado de los “nibs”
Las almendras fermentadas y
secas fueron quebradas en un desintegrador de cuchillas, en pedazos menores.
Posteriormente los cotiledones fragmentados fueron separados de la cáscara y del germen
con el auxilio de una columna de aire. Los nibs así separados, fueron seleccionados por
tamaño, a través de cernido, obteniéndose las fracciones entre 2 y 6 mm. El tratamiento
con polifenoloxidasa fue realizado en “nibs”, autoclavados (121 ºC, 15
min.) y no autoclavados. Para tal efecto, estos “nibs” (50 g para cada réplica)
fueron embebidos en una solución de enzima conteniendo 200U/ml/min, durante 30, 60, 90,
150, 210 y 360 minutos, a 23 ºC y pH 6. Los análisis para los diferentes tiempos de cada
tratamiento fueron realizados por triplicado.
b)
Determinación de fenoles totales
Esta determinación fue
realizada de acuerdo con la metodología, modificada, descrita por PRICE & BUTLER,
1977.
Extracción de fenoles: Fue
realizada según la metodología modificada, descrita por BARTOLOMË et al, 1995. Nibs
finamente molidos fueron desengrasados con solvente. Alícuotas de polvo
desengrasado y seco (1 g) fueron pesadas y extraídas con 15 ml de una solución de
acetona/agua (70:30) refrigerada a 4 ºC con agitación durante 20 min. y finalmente
centrifugadas 10 min. x 1500 r.p.m. Alícuotas de 0,5 ml de sobrenadante fueron
completadas con 0,5 ml de agua y sometidas a determinación.
La cuantificación de fenoles
totales fue realizada adicionando 3 ml de una solución 0,10 M de FeNH4(SO4)2 en 0,10 M de
HCl fueron adicionados a la alícuota de estrato (1 ml) y sometidos a agitación, 20 min.
después se adicionó 3 ml de una solución 0,008 M de K3Fe(CN)6 finalmente 20 minutos
después de la adición del último reactivo fue leída la absorbancia a 720 nm (VIS).
Para la cuantificación de los fenoles fue construida una curva con diferentes
concentraciones de ácido tánico.
c)
Determinación de taninos
La cuantificación de taninos
fue realizada siguiendo la metodología descrita por HAGENNAN & BUTHER, 1978.
Extracción de taninos:
Alícuotas de 0,05 g de polvo de cacao desengrasados fueron pesadas y
extraídas en 4 etapas con MeOH 50%, la primera etapa da extracción fue conducida con 2
ml de MeOH 50% con agitación durante 8 min., la segunda etapa fue realizada en un baño
de agua a 80-85 ºC también con 2 ml de MeOH 50% sin agitación con tiempo de permanencia
de 8 min., la tercera etapa fue idéntica a la segunda y la cuarta etapa fue realizada con
adición de 4 ml de MeOH 50% en las mismas condiciones de las anteriores. Al final del
proceso de extracción fueron obtenidos en total 10 ml de extracto.
Cuantificación de taninos: La
determinación de taninos en el extracto fue realizada siguiendo el método descrito por
HAGENNAN & BUTHER, 1978, para la cuantificación se utilizó una curva construida con
diferentes concentraciones de ácido tánico.
d)
Determinación de flavan-3-ols
Esta determinación fue
conducida siguiendo la metodología, modificada, descrita por MAILLARD et al, 1996.
Cuantificación de flavan-3-ols:
Alícuotas de polvo desengrasado y seco de 0,025 g fueron extraídas 4 veces, durante 10
min. en 10 ml de MeOH en cada extracción, todos los extractos reunidos fueron filtrados a
través de papel filtro y filtrado evaporado hasta secarlo. El residuo fue disuelto en 5
ml de agua y 5 ml de sulfato de amonio (400g/L), esta mezcla fue acidificada hasta pH 3
con ácido metafosfórico (200g/ml), con la ayuda de un embudo de separación se realizó
3 extracciones con 10 ml de acetato de etil en cada extracción, los 30 ml recuperados de
la extracción fueron evaporados hasta secar y posteriormente el residuo fue disuelto en
15 ml de MeOH, finalmente fue leída la absorbancia a 280 nm (UV). Para la cuantificación
se usó una curva construida con diferentes concentraciones de catequina.
e)
Determinación de antocianidinas
La determinación fue realizada
siguiendo la metodología, modificada, descrita por Oszmianski & Sapis, (1988); en
Wilska-Jeszka & Koren, (1996).
Extracción y cuantificación de
antocianidina:
0,05 g de polvo desengrasado y
seco fueron extraídos 4 veces con 2,5 ml de una solución 1,5 N de HCl y etanol absoluto
(85:15) con agitación durante 3 min. en cada extracción y finalmente centrifugación
durante 5 min. a 2000 r.p.m., el total de los sobrenadantes (10 ml) fue recogido en un
vaso de precipitado y evaporados hasta secar, el residuo fue disuelto en 5 ml de etanol y
leído a 535 y 460 nm (VIS).
Se puede observar de manera
general que las concentraciones de fenoles totales, taninos, flavan-3-ols y de
antocianidinas disminuyen considerablemente con la acción de la enzima polifenoloxidasa,
con todo no existió diferencia significativa (p<0,05) en el resultado después 210
min. de tratamiento de nibs autoclavados. La Tabla 2 presenta los resultados de
cuantificación de fenoles totales en polvo de cacao desengrasado obtenido a partir de
nibs de cacao tanto autoclavados como no autoclavados. La disminución de fenoles totales
en el tratamiento enzimático de los nibs no autoclavados llegó a 15% después 210 min.,
en el caso de los nibs autoclavados ésta perdida llegó a 24%, estos porcentajes fueron
obtenidos con relación a nibs no autoclavados y sin tratamiento enzimático.
La Tabla 3 presenta la
cuantificación de taninos en polvo desengrasado obtenido a partir de nibs autoclavados y
no autoclavados tratados enzimáticamente. Se puede observar que la disminución de
taninos después de 210 min. de tratamiento llegó a 15% en el caso de los nibs no
autoclavados y a 26% en los nibs autoclavados.
| Tratamiento
(min.) |
No autoclavados |
Autoclavado |
| sin enzima |
26,45 |
25,28 |
| 30 |
25,75a |
24,94a |
| 60 |
24,54b |
24,17a |
| 90 |
23,21c |
23,66ab |
| 150 |
22,58c |
21,07bc |
| 210 |
23,34c |
19,87c |
| 360 |
20,80d |
20,24c |
Tabla 2.
Concentración de Fenoles Totales
en Polvo de Cacao (%)
Los valores de una misma
columna, con la misma letra, no difieren significativamente entre sí (Test de Tukey,5% de
significancia).
| Tratamiento
(min.) |
No autoclavado |
Autoclavados |
| sin enzima |
7,81 |
7,26 |
| 30 |
7,85a |
7,08a |
| 60 |
7,83b |
6,47ab |
| 90 |
7,47ab |
6,23bc |
| 150 |
6,64bc |
6,08bcd |
| 210 |
6,59bc |
5,71cd |
| 360 |
6,23c |
5,39d |
Tabla 3.
Concentración de Taninos en Polvo
de Cacao (%), Tratados con Polifenoloxidasas.
Los valores de una misma columna, con la misma letra,
no difieren significativamente entre si (Test de
Tukey a 5% de significancia).
La Tabla 4 presenta los
resultados de cuantificación de flavan-3-ols en polvo desengrasado obtenido a partir de
nibs autoclavados y no autoclavados tratados enzimáticamente, la pérdida de flavan-3-ols
después de 210 min. de tratamiento llegó a 10% en el caso de los nibs no autoclavados y
a 23% en los nibs autoclavados. El autoclavado aquí como en todos los otros tratamientos
tuvo una influencia positiva en lo que respecta a la acción de la enzima, incrementando
considerablemente la disminución de los compuestos polifenólicos.
La Tabla 5 muestra los
resultados de la cuantificación de antocianidinas en polvo desengrasado obtenido a partir
de nibs autoclavados y no autoclavados tratados enzimáticamente. Una vez más la
disminución de los compuestos polifenólicos en nibs autoclavados fue mayor comparada a
la disminución en nibs no autoclavados, con todo la diminución de los compuestos
polifenólicos fue significativa en los dos tratamientos. La disminución de taninos
después de 210 min. de tratamiento llegó a 18% en el caso de los nibs no
autoclavados y a 51% en los nibs autoclavados.
Además de la disminución de
los compuestos polifenólicos, se observó un cambio en el color de los nibs después del
tratamiento enzimático, los nibs al final quedaron con un color marrón perdiendo la
coloración violeta.
| Tratamiento
|
No autoclavado |
Autoclavado |
| sin enzima |
23,16 |
23,28 |
| 30 |
23,10a |
19,71a |
| 150 |
22,47b |
20,59a |
| 210 |
20,80a |
17,75a |
| 360 |
18,39a |
16,02a |
Tabla 4.
Concentración de Flavan-3-ols en Polvo de Cacao(%)
Los valres de una misma columna, con la misma letra,
no difieren significativamente entre si (Test de
Tukey a 5% de significancia).
| Tratamiento
|
No autoclavado |
Autoclavadoa |
| sin enzima |
2,12 |
1,83 |
| 30 |
1,884a |
1,619a |
| 60 |
1,874a |
1,481ab |
| 90 |
1,7335b |
1,407ab |
| 150 |
1,72b |
1,218bc |
| 210 |
1,733b |
1,029c |
| 360 {6} |
1,634c |
1,033c |
a
Valores obtenidos en la lectura de absorbancias,
(535nm/462nm),
lA/lB
Tabla 5.
Cuantificación de Antocianidinas en
Polvo de Cacao Tratado con Polifenoloxidasas.
Los valores de una misma columna, con la misma letra,
no difieren significativamente entre si (Test de
Tukey a 5% de significancia).
Sobre la base de los resultados experimentales son hechas las siguientes
conclusiones:
a) Una reducción significativa de los compuestos fenólicos, presentes en
el cacao insuficientemente fermentado, puede ser obtenida con el uso de la enzima
polifenoloxidasa.
b) La acción de la enzima polifenoloxidasa fue más efectiva en nibs
autoclavados.
c) Se obtuvo un resultado significativo con relación a las antocianidinas
en “nibs” autoclavados y tratados enzimáticamente, consecuentemente el color
violeta característica de pigmentación de estas antocianidinas, diminuyó casi
totalmente dando lugar al color marrón.
| Referencias
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