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Resumen - Se buscó un método alternativo y confiable al método convencional (colección total de heces) para la determinación indirecta de la digestibilidad y el consumo de una ración en ratas, utilizando un indicador interno (lignina) y un externo (Cr2O3). Con este fin, se elaboró una dieta estándar para ratas machos wistar, de la cual se determinó el consumo de materia seca y digestibilidad aparente de los nutrientes principales: materia seca, energía, proteína y fibra.

El consumo promedio de materia seca total, materia seca relativa al peso vivo y materia seca por unidad de peso metabólico establecidos por el método convencional fueron los siguientes: 18.9±18 g/d, 5.7±0.3% y 43.2±2.4 g/d respectivamente; mientras que los consumos establecidos por el método lignina fueron: 19.8±2.6 g/d, 6.0±0.7% y 45.5±5.3 g/d respectivamente y los establecidos por el método Cr2O3 fueron: 20.1±1.8 g/d, 6.1±0.4% y 46.1±3.2 g/d respectivamente. Resultando sólo el método alternativo lignina estadísticamente similar al convencional y por consiguiente el más confiable en la determinación de estos criterios de consumo.

La estimación de la digestibilidad promedio de materia seca por el método convencional fue de 82.1±1.2%, por el método lignina 82.8±1.3% y por el método Cr2O3 83.1±1.5%, siendo el método lignina el método alternativo más confiable para este componente; mientras que para la digestibilidad de la proteína, ambos métodos alternativos resultaron estadísticamente confiables con valores de 73.5±2.0, 72.6±2.8 y 72.4±2.1% obtenidos con los métodos convencional, lignina y Cr2O3 respectivamente. En cambio, para la digestibilidad de la energía el método del Cr2O3 fue la mejor alternativa en función a los resultados obtenidos: 80.3±1.2 (convencional), 79.6±1.1 (Ccr2o3) y 78.2±1.4%(lignina). De igual manera, para la digestibilidad de la fibra el método Cr2O3 resultó ser la alternativa más confiable, obteniéndose los siguientes coeficientes de digestibilidad según métodos: 33.9±7.0% (convencional), 29.3±8.8% (Cr2O3) y 26.9±6.4% (lignina).

La determinación indirecta de la digestibilidad y el consumo de raciones por animales ha alcanzado gran importancia. El interés por el presente trabajo surgió del conocimiento de que las observaciones cualitativas y cuantitativas de la digestibilidad y consumo que se realizan bajo las condiciones de laboratorio, no siempre representan lo que el animal realmente consume bajo condiciones normales de cría. Estas diferencias limitan notablemente las posibilidades de predecir el comportamiento de monogástricos y poligástricos bajo condiciones normales de cría a partir de los resultados obtenidos en laboratorio.

Se obtuvo un notable avance con el conocimiento de que se podía emplear la concentración de ciertos componentes químicos en las heces fecales para predecir la digestibilidad de la ración que consumían. Desde las primeras sugerencias hechas por lancaster (1949) y reid et.al.(1950), los métodos de los llamados “índices fecales” han sido empleados repetidamente para medir la digestibilidad y el consumo de varias raciones y forrajes en diferentes especies animales (greenhalgh y corbett, 1962; greenhalgh y runcie, 1980). La aplicación de los índices fecales requiere la predicción de la digestibilidad de la ración a partir de la concentración del “indicador” en las heces resultantes. Como se trata de predecir a partir de una regresión determinada previamente, las medidas llevan un error inherente, que al ser grande invalida las observaciones realizadas. Así, las relaciones de causa y efecto obtenidas para una especie, no se ajustan necesariamente a otras especies.

El consumo de materia seca tanto en poligástricos en pastoreo como en monogástricos es controlado en gran medida por los efectos de la composición de la dieta, principalmente la digestibilidad, en la tasa de desaparición de material del sistema digestivo y probablemente también por la palatabilidad. En adición, el consumo de alimento es un aspecto fundamental de la nutrición ya que este controla el ingreso de todos los nutrientes y por consiguiente determina la respuesta y función animal. La digestibilidad y la utilización de los nutrientes son en sí solo descripciones cualitativas del consumo neto del alimento.

La digestibilidad es altamente relevante y clave en el desarrollo de sistemas nutricionales alternativos para animales. Particularmente, cuando se pretende usar subproductos agrícolas o industriales como ingredientes basales de raciones para animales. Sin embargo, los métodos tradicionales de determinación de digestibilidad son costosos y laboriosos y las técnicas alternas necesitan ser calibradas previo a su uso alternativo. Por consiguiente, el desarrollo y validación de técnicas de laboratorio confiables y aplicables, es probablemente una vía de alta prioridad para mejorar la nutrición de los animales de interés.

Comparar técnicamente la sensibilidad de métodos alternativos: indicador interno “lignina” e indicador externo “óxido crómico” con relación al método convencional “colección total de heces” en la definición del consumo de materia seca y de los coeficientes de digestibilidad de los nutrientes de una dieta estándar utilizando ratas machos Wistar.

Localización

Las pruebas biológicas se realizaron en las instalaciones del bioterio perteneciente al programa de nutrición del departamento de biología, que está ubicado en la facultad de ciencias y tecnología de la UMSS, en la ciudad de Cochabamba. Geográficamente está situada entre los paralelos 17º23’09’’ de latitud sur y, 65º09’35’’ de longitud oeste, con una altitud de 2 557 m.s.n.m., temperatura promedio de 18ºc, precipitación anual de 450 mm y humedad relativa del 50%.

Infraestructura

La prueba de digestibilidad fue llevada a cabo en 15 jaulas metabólicas individuales de metal con rejilla en la base que permitía el paso de las heces y percolación de orina. Cada una fue equipada con bandejas recolectoras de heces, comederos y bebederos individuales.

Material biológico

Un total de 15 ratas albinas (Rattus norvergicus) machos Wistar, que pesaban alrededor de 309±18.9 g (media ± sd) al inicio del ensayo, con edades similares que oscilaban entre 115±5 días fueron usados.

Métodos

En base de la composición química de los insumos: harina de maíz amarillo (Zea maiz), harina de alfalfa (Medicago sativa) al 5% de floración, leche entera deshidratada pil y leche descremada deshidratada pil y según los requerimientos nutricionales de las ratas adultas se realizó el balance de la dieta con ayuda del software mixit. Conocidos los porcentajes de inclusión de cada ingrediente en la dieta, estos se mezclaron uniformemente con 50% de agua para someterse a peletización.

Para evaluar los coeficientes de digestibilidad aparentes (cda) de la dieta por medio de los indicadores, se incluyó al alimento el marcador externo óxido crómico en un 0.2% y se determinó la concentración del marcador interno lignina en el mismo.

Los animales fueron instalados en un cuarto con temperatura controlada (20 – 22 ºC), humedad relativa (45 – 55%). Los mismos fueron mantenidos bajo condiciones de iluminación controlados con ciclos de oscuridad alternada (18:00 – 08:00) y luz (08:00 – 18:00) y tuvieron libre acceso al alimento y agua.

Las ratas del ensayo fueron distribuidas según sus pesos iniciales en 5 cuadrados latinos, siendo similar la distribución de los pesos corporales entre cuadrados. Cada cuadrado fue conformado por tres individuos, donde las columnas representaron al animal correspondiente y las hileras a los períodos de tiempo. Todos los animales de experimentación estuvieron sujetos a la evaluación de la digestibilidad de la dieta y consumo de la misma por medio de tres métodos (colección total, lignina y óxido crómico) en forma aleatoria. El ensayo estuvo compuesto por tres períodos, donde cada período tuvo una duración de 12 días, y cada método contó con 5 repeticiones por período.

La ubicación de los animales, períodos y métodos se representa en el siguiente esquema:

Fase pre-experimental - Tuvo una duración de 7 días, con el propósito de adaptar a las ratas a las condiciones de la jaula metabólica y modificar la microflora intestinal al tipo de alimento a probarse; determinar la cantidad de alimento a consumir por día, de manera que la cantidad de alimento esté de acuerdo con el consumo real de cada uno de los animales en la etapa experimental y obtener la cantidad suficiente de heces para poder realizar los análisis químicos.

Fase experimental - Cada fase tuvo 5 días de duración (del 8º al 12º día de cada período), en cada una de las cuales se realizaron las siguientes actividades: a) se obtuvo el peso corporal diario de cada uno de los individuos, b) se ofreció 25 g de alimento a las 08:00 todos los días, c) se recolectó y pesó el alimento rechazado de cada jaula, para determinar el alimento consumido, d) las heces producidas diariamente fueron cuantificadas y refrigeradas individualmente en bolsas de polietileno debidamente identificadas, entre las 08:30 a 10:30 a.m. Una vez finalizada la fase experimental, se procedió al secado y molido de las muestras fecales para sus posteriores análisis químicos.

Análisis químico

Los análisis químicos tanto del alimento como de las heces producidas en los tres períodos se llevaron a cabo siguiendo el análisis químico nutricional, método de aoac (1984) estandarizados por el programa de nutrición.

Se efectuaron los siguientes análisis químicos: humedad, proteína, energía, extracto etéreo, fibra cruda, eln o carbohidratos totales y ceniza. La determinación de la concentración del marcador interno “lignina” en las muestras, fue llevada a cabo en el laboratorio de bromatología de la estación experimental de patacamaya – la paz.

El óxido crómico en el alimento y heces fue determinada por la técnica de absorción atómica según furukawa y tsukahara (1966).

Determinación de lignina en el alimento y heces

Llevado a cabo por el método de la aoac(1990), en el que se determina la fibra detergente ácida como paso preparatorio para el análisis de lignina en un residuo libre de las interferencias de la proteína.

Cálculo de digestibilidad por indicador

Cálculo de digestibilidad por colección total de heces

(total de nutrimento consumido) – (total nutrimento en heces) = nutrimento digerido

Determinación de consumo diario de alimento utilizando indicador

Determinación de consumo diario de materia seca de alimento por colección total

Consumo = (alimento ofrecido en materia seca – alimento rechazado en materia seca)

Análisis estadístico

Los datos fueron analizados utilizando un modelo lineal perteneciente al diseño experimental de cuadrados latinos 3 x 3 (rodríguez del angel, 1991), para evaluar estadísticamente las siguientes fuentes de variación: animales, métodos y períodos experimentales. Para establecer las diferencias o similitudes entre métodos y períodos se realizó una comparación múltiple de medias. La significancia de las diferencias entre las distintas fuentes de variación fue establecida en los análisis de varianza (anva) con los tests de f/t y, la comparación múltiple de medias por el test de tukey, utilizando el programa spss (versión 7.5)

Modelo estadístico

Donde: m = media general, ai = efecto debido a los animales, M_j = efecto de los métodos, P_k = efecto de los períodos, e_ijkl = error experimental

Los resultados se agrupan secuencialmente en el siguiente orden: análisis de la composición de la ración, determinación del consumo de materia seca por el animal y determinación de los coeficientes de digestibilidad.

Composición de la ración

Los resultados de los análisis bromatológicos en la ración para ratas adultas wistar fueron resumidas en el cuadro 1.

Fuente: laboratorio de nutrición, facultad de ciencias y tecnología – UMSS

La energía bruta de la ración tuvo un valor de 3801 kcal/kg. De acuerdo con el requerimiento de la rata establecido por el nrc (1990), éste contenido de energía cubre satisfactoriamente el requerimiento de 3800 kcal/kg de ración para ratas. La proteína bruta en la ración, utilizada en la prueba biológica fue de 14.5%, valor esperado teóricamente y superior en 2.5% al requerimiento sugerido por nrc (1990). El porcentaje de fibra presente en la dieta fue de 7.4%, promedio superior en 2.4% al requerimiento de las ratas (5%); no obstante, la literatura indica que valores aproximados a 7.4% de fibra se encuentran en dietas comunes de estos animales (nrc, 1990).

Consumo de materia seca por los animales

Se midió el consumo en condiciones de alimentación ad-libitum, para ello se evaluaron dos métodos como alternativa al método tradicional para determinar el consumo de la dieta en ratas de laboratorio, el primero usando la lignina como indicador interno (m2) y el segundo –óxido crómico- (m3) como indicador externo contra un testigo m1 (colección total de heces). Se evaluaron tres criterios de consumo diario por animal a saber: materia seca total (mst), materia seca relativo al peso vivo (ms %pv) y materia seca por unidad de peso metabólico (g ms/kg0.75). El uso de estos criterios estuvo basada en la presunción de que el consumo está relacionado con la masa corporal con el tamaño metabólico (van soest, 1987). En el cuadro 2 se muestra el consumo promedio de la dieta, determinado por cada método para los criterios de evaluación mencionados.

El promedio general para consumo de materia seca en ratas adultas machos wistar fue de 19.6 ± 2.1 g/día; este consumo fue semejante a 20.0 ± 0.6 g/d reportado por yu y beynen (1994) para ratas machos wistar con 249 ± 6.2 g de peso corporal, que consumieron una dieta formulada de acuerdo a los requerimientos nutricionales de las ratas recomendado por el NRC (1978), en condiciones ambientales similares. Al respecto, NRC (1990), indica que los procedimientos experimentales y condiciones ambientales pueden alterar los requerimientos de uno o más nutrientes. Por ejemplo, la prevención de la coprofagia o el mantenimiento de las ratas en un estado libre de enfermedades, puede incrementar el requerimiento de los nutrientes suministrados en parte por la microflora intestinal (hotzel y barnes, 1996). En la prueba de los métodos alternos (lignina y óxido crómico) contra el testigo (colección total), se encontró que la lignina fue un método tan confiable como el testigo en la determinación del consumo de materia seca total en ratas de laboratorio.

Consumo de materia seca como porcentaje del peso vivo

El promedio para el consumo de materia seca como porciento del peso vivo fue de 5.9 ± 0.5%, resultado similar al encontrado por burgos y martinez (1989) quienes estimaron que una rata consume una media de 5 g de alimento diariamente por cada 100g de peso vivo. Para los propósitos de esta investigación resultó que M2 fue el método alterno al testigo (M1) en la predicción confiable del consumo de materia seca en ratas de laboratorio.

En la prueba biológica el consumo medio de materia seca por Kg de peso metabólico fue de 44.9 ± 3.6 g/día, encontrándose también en este criterio que, los métodos M1 (medido por diferencia entre la oferta y rechazo diario de la ración) y M2 (lignina) fueron dos procedimientos estadísticamente semejantes (P = 0.085) en la determinación de este criterio de consumo.

Los coeficientes de digestibilidad aparente obtenidos por los tres métodos están resumidos en el cuadro 3.

Cuadro 3. Coeficientes de digestibilidad aparente (%) de una ración estándar de ratas machos wistar determinado según tres métodos

Digestibilidad aparente de la materia seca

El promedio general para el porcentaje de digestibilidad de la materia seca fue de 82.7 ± 1.3%. De los resultados (cuadro 3) es claro que el uso de la lignina como marcador interno (m2) resultó una metodología alternativa confiable al método m1 en la evaluación de la digestibilidad de la materia seca en raciones estándar de ratas adultas. El análisis de varianza (cuadro 4), mostró que las principales fuentes de variación fueron: las variaciones entre animales y los métodos de determinación de la digestibilidad.

Cuadro 4 Análisis de varianza para la digestibilidad aparente de la materia seca

Digestibilidad aparente de la energía bruta

La digestibilidad promedio de la energía bruta de la ración estándar fue 79.4 +/- 1.2. Un resumen del análisis de varianza para este componente se presenta en el cuadro 5.

Cuadro 5 Análisis de varianza para la digestibilidad aparente de la energía

Si se considera que el valor 80.3% establecido por el método testigo o colección total (m1) como el mejor estimador de la digestibilidad de la energía presente en la ración estándar, se encontró que el método del indicador interno m2 tendió a subvalorar la digestibilidad aparente de este componente, a diferencia del óxido crómico que resultó ser similar al de colección total.

El coeficiente de digestibilidad proteínica de la ración estándar de ratas, medido a través de tres métodos tuvo una media general de 72.8 ± 2.3%. El análisis de varianza de este componente presente en el cuadro 6, muestra que las diferencias entre animales en la habilidad para digerir la proteína fue la única fuente significativa de variación. También, resulta interesante remarcar que los tres métodos en estudio fueron estadísticamente similares para el propósito de evaluar la digestibilidad de la proteína cruda.

Cuadro 6 Análisis de varianza para la digestibilidad aparente de la proteína de una ración estándar para ratas

Digestibilidad aparente de la fibra

La media general para el coeficiente de digestibilidad del contenido de fibra en la dieta determinada por los tres métodos utilizados fue de 30.0 ± 7.4%.

El análisis de varianza para este parámetro fue resumido en el cuadro 7, donde se observa que la principal fuente de variación constituyeron los métodos de determinación de digestibilidad (P = 0.028).

El método M1 determinó un coeficiente significativamente mayor (P = 0.024) a M2, y entre M1 y M3 no se encontró diferencia estadística, mostrando que el óxido crómico puede ser un método confiable en la determinación de la digestibilidad de la fibra.

El consumo promedio de la materia seca en ratas adultas machos wistar con 331.4 ± 25 g de peso corporal, fue de 19.6 g/d. Por otro lado, el consumo medio de materia seca como porcentaje del peso vivo fue de 5.9 ± 0.5%. Finalmente, el consumo de materia seca según el peso metabólico fue de 44.9 ± 3.6 g/d, encontrándose en estos tres criterios que, los métodos M1 (testigo) y M2 (lignina) fueron dos técnicas estadísticamente semejantes (P = 0.085). Significando que el método de la lignina puede ser utilizado confiablemente en la determinación del consumo de materia seca.

La digestibilidad aparente promedio de la materia seca fue de 82.7 ± 1.3% y en el análisis comparativo entre métodos, sólo el método M3 resultó ser estadísticamente diferente de M1; de lo que se concluye que el uso de la lignina como marcador interno resultó en una alternativa confiable en la determinación de la digestibilidad de este componente.

En la determinación de la digestibilidad aparente de la energía, existieron diferencias estadísticas entre M2 con M1, a diferencia de M3 con M1. De manera que el óxido crómico es el mejor método alternativo para la estimación de la digestibilidad de este componente que alcanzó un valor medio de. 79.4 ± 1.2%.

Los tres métodos evaluados no alcanzaron a tener diferencias estadísticas en la obtención de coeficientes de digestibilidad aparente de la proteína, que alcanzó un valor promedio de 72.8 ± 2.3%. Lo que sugiere que ambos métodos alternativos pueden aplicarse confiablemente en la determinación de la digestibilidad de este nutriente.

La media general para el coeficiente de digestibilidad del contenido de fibra en la dieta fue de 30.0 ± 7.4%. Existiendo diferencias estadísticas entre el indicador lignina y el método testigo; pero no así entre M1 Y M3; por consiguiente, el método del óxido crómico puede aplicarse en la determinación de la digestibilidad de este componente.

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Período	Rata 1	Rata 2	Rata 3	Período	Rata 4	Rata 5	Rata 6
Pi	Cr2o3	Col.tot.	Lignina	Pi	Cr2o3	Lignina	Col.tot.
Pii	Col.tot.	Lignina	Cr2o3	Pii	Lignina	Col.tot.	Cr2o3
Piii	Lignina	Cr2o3	Col.tot.	Piii	Col.tot.	Cr2o3	Lignina

Período	Rata 7	Rata 8	Rata 9	Período	Rata 10	Rata 11	Rata 12
Pi	Cr2o3	Col.tot.	Lignina	Pi	Cr2o3	Col.tot.	Lignina
Pii	Col.tot.	Lignina	Cr2o3	Pii	Lignina	Cr2o3	Col.tot.
Piii	Lignina	Cr2o3	Col.tot.	Piii	Col.tot.	Lignina	Cr2o3

Período	Rata 13	Rata 14	Rata 15
Pi	Col.tot.	Lignina	Cr2o3
Pii	Cr2o3	Col.tot.	Lignina
Piii	Lignina	Cr2o3	Col.tot.

Consumo de ms	M1	M2	M3	Media gral. ± sd
Total (g/d)	18.9 ± 1.8 a	19.8 ± 2.6 ab	20.1 ± 1.8 b	19.6 ± 2.1
% del peso vivo	5.7 ± 0.3 a	6.0 ± 0.7 ab	6.1 ± 0.4 b	5.9 ± 0.5
Peso met. Ms/kg0.75 (g/d)	43.2 ± 2.4 a	45.5 ± 5.3 ab	46.1 ± 3.2 b	44.9 ± 3.6
Peso corporal medio (g)	332.5 ± 25.7 a	330.7 ± 27.5 a	331.0 ± 23.3 a	331.4 ± 25.0
A, b medias en la misma fila con diferentes superíndices fueron significativamente diferentes (p £ 0.05).

Componente	M1	M2	M3	Promedio gral.
Materia seca	82.1 ± 1.2 a	82.8 ± 1.3 ab	83.1 ± 1.5 b	82.7 ± 1.3
Energía	80.3 ± 1.2 b	78.2 ± 1.4 a	79.6 ± 1.1 b	79.4 ± 1.2
Proteína	73.5 ± 2.0 a	72.6 ± 2.8 a	72.4 ± 2.1 a	72.8 ± 2.3
Fibra bruta	33.9 ± 7.0 b	26.9 ± 6.4 a	29.3 ± 8.8 ab	30.0 ± 7.4
A, b medias en la misma fila con diferentes superíndices fueron significativamente diferentes : p £ 0.05

Cecilia Gutiérrez

Docente de Parasitología de UNIVALLE